在液体活检的研究中，基于表面上皮标志物(EpCAM和CK)的循环肿瘤细胞(CTC)检测策略虽然应用较为广泛，但仍然存在许多局限性。研究表明，CTC 中的肿瘤相关 miRNA与癌症的发生和发展具有高度相关性，具有成为肿瘤表征和鉴定标志物的巨大潜力。目前，高通量地针对单个CTC在活细胞水平开展原位分析，并进一步实现多个miRNA的同步分析，仍然是十分具有挑战性的工作。然而，新型的二维纳米材料——金属有机框架(MOF)因其结构可控、功能多样的特性，为研究人员提供了活细胞探针载体的新思路。

近日，中国科学院深圳先进技术研究院陈艳团队联合清华大学深圳国际研究生院谭英团队、香港理工大学杨莫团队提出了一种新型的2D MOF纳米传感器集成的液滴微流控流式细胞仪(Nano-DMFC)，可应用于CTC单细胞miRNA的原位多重检测。该研究工作以陈俊粤、格日乐为共同一作，以“2D MOF Nanosensor-Integrated Digital Droplet Microfluidic Flow Cytometry for In Situ Detection of Multiple miRNAs in Single CTC Cells”为题发表在权威学术期刊Small(DOI: 10.1002/smll.202201779)上。

本研究开发了一种新型的2D MOF纳米传感器集成的液滴微流控流式细胞仪(Nano-DMFC)，突破了目前活细胞中核酸原位分析的技术瓶颈，高通量地实现了样本中单个CTC活细胞miRNA的原位、多重、定量分析。该纳米传感方案以金属有机框架MOF为猝灭剂，双色荧光染料标记DNA探针为供体，首次合成了用于双重miRNAs检测的生物功能化MOF荧光共振能量转移(FRET)纳米探针。该2D MOF纳米传感器修饰了两种乳腺癌靶向多肽序列，以增加肿瘤细胞靶向和内体逃逸能力。集成2D MOF纳米传感器的数字液滴微流控流式细胞仪，可以实现单个乳腺癌细胞中双重miRNA标志物(miRNA-21和miRNA-10a)的原位检测。

纳米传感器集成的液滴微流控流式细胞仪由三部分组成: 单细胞液滴发生器，纳米探针微注射单元和液滴荧光检测单元。Nano-DMFC系统首先产生单细胞液滴，然后2D MOF纳米传感器被精确地微注射到每个单细胞液滴中，在活细胞水平实现单个肿瘤细胞中的双重 miRNA表征。在单个肿瘤细胞内存在目标miRNA时，MOF纳米片上的染料标记的ssDNA 与其靶标形成杂交双链DNA (dsDNA)，dsDNA和MOF之间的相互作用减弱，使得dsDNA从MOF表面分离，最终触发荧光的恢复。不同类型的 miRNA 在单个细胞中会产生不同的荧光信号。最后，使用光纤集成的液滴流式检测装置，在纳米探针孵育后对液滴中的信号进行检测和分析，从而实现对单细胞中双重miRNA的检测。实验结果表明，Nano-DMFC平台能够以双重miRNA为靶标在仿生样本(含有10,000个阴性上皮细胞)中检测出10个阳性CTC细胞，同时在加标血液样本的回收实验中表现出良好的重复性，因此该平台成功验证了以miRNA为标志物的CTC检测新策略。Nano-DMFC系统作为一种小型化、高度集成、操作简易的活细胞miRNA分析平台，为研究肿瘤细胞异质性和鉴定细胞亚型提供了新的思路，在临床研究中具有癌症早期诊断和术后监测的潜力。

本研究工作得到了国家自然科学基金、广东省粤港联合创新领域项目、深圳市科技创新委、香港研究资助局等多个项目经费的资助。

近日，中国科学院深圳先进技术研究院(简称“深圳先进院”)医工所微纳中心的陈艳团队在肿瘤液体活检领域取得重要进展，研发了一种创新的微流控技术，能够同时分选癌症患者外周血中的循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells, CTCs)和循环融合细胞(Circulating fusion cells, CFCs)，可以一步式从全血样品中分离出高纯度、高活性的CTCs和CFCs，并完成高通量单细胞转录组测序分析。相关研究成果以Cascaded filter deterministic lateral displacement microchips for isolation and molecular analysis of circulating tumor cells and fusion cells为题发表在微流控领域顶尖期刊Lab on a Chip。深圳市瑞格生物科技的刘宗彬博士、深圳市第二人民医院的刘爱学主任、深圳先进院的陈艳研究员为论文的共同通讯作者。

一个世纪以前，德国病理学家Otto Aichel发现肿瘤细胞可以和免疫细胞融合，形成的融合细胞同时具备免疫细胞运动能力和肿瘤细胞的成瘤能力，更容易通过循环系统在体内扩散转移，但由于技术手段的限制，这类融合细胞很难分选出来，无法做更深入的分析。

在本研究中，研究人员提出了一种创新的“过滤式确定性侧向位移”(filter-DLD)的概念，通过微纳结构设计和有限元多物理场分析，构建了一种流体力学新结构，可实现细胞运动轨迹精准操控。这种结构不但比传统设计具有更低的临界细胞分离尺寸，而且对血液中占比最多的红细胞有极好的过滤效果。研究人员同时利用创新的流体力学结构，将filter-DLD结构整合成高度集成的级联式芯片(CFD-Chip)，一方面大大提升了样品分离的通量，另一方面通过不同微结构的组合实现CTCs和CFCs的高效分选：捕获效率>96%，极高的纯度 (白细胞去除率99.995%)，高活性(>98%)。因此，CFD-chip在循环稀有细胞的分选中展示出极其优越的性能。微流控芯片无标记分选的便捷流程以及全血样本的处理模式，为肿瘤液体活检的临床推广提供了科研利器。

研究人员使用CFD-Chip分析了近百例临床肺癌患者的样本，高效地收集了CTCs，并鉴定了一种新的CTC亚群：肿瘤细胞-白细胞融合细胞(CFCs)，CFCs同时表达肿瘤细胞和白细胞marker。患者样品中CTCs水平的变化，可以有效地应用于治疗效果的评估和病情的动态监测。由于从CFD-Chip平台获取的肿瘤细胞具有极高的活性，可以直接用高通量单细胞RNA测序进行下游分析，结果显示肺癌病人外周血中存在比CTCs数量更多的CFCs细胞。CFCs有望揭示肿瘤演化和转移的新机制，为肿瘤早期诊断、预后判断、疗效监控、复发预测提供一种新型标志物。

该研究工作得到了国家自然科学基金、中科院青年创新促进会和广东省、深圳市等科技项目的资助。

microRNA(微小RNA，又称miRNA)是真核生物中广泛存在的一种长约18-24个核苷酸的非编码单链RNA，在基因表达调控中有非常重要的作用，近年来，miRNA作为液体活检的重要标志物之一，备受科研和临床研究的关注，由于miRNA具有含量少，序列短，相似性高并且容易被环境中的RNA酶降解等特点，其检测一直面临很多技术挑战。在这篇文章中，中国科学院深圳先进技术研究院的陈艳团队、金宗文团队的研究人员提出了一种新颖的微流控光学芯片，通过一种具有三元结构的新型分子探针和高度集成的片上检测单元，实现了目标miRNA分子的特异性识别和快速定量分析。该研究工作以“A compact fiber-integrated optofluidic platform for highly specific microRNA Förster resonance energy transfer detection” 为题发表在 Analyst (DOI: 10.1039/D1AN00324K)，并被选为封面文章。

本研究提出了一种新颖的miRNA检测方法，采用光流控技术搭建了一套小型化的核酸检测平台，可实现快速、简易、高灵敏、高特异性的miRNA定量检测。核酸检测选择了无需核酸扩增的一步式检测方案，基于傅氏共振能量转移原理(FRET)，通过一种具有三元结构的新型分子探针，实现目标miRNA分子的特异性识别。

在检测平台中，首先利用液滴微流控技术将供体、受体和miRNA包裹在液滴中，然后依次在芯片上完成液滴混匀、孵育、检测等步骤。供体、受体和miRNA在液滴中可快速形成三向偶联结构(three-way junction)，供体和受体的距离缩小至10 nm以内。基于FRET原理，供体被激发时，能量快速转到受体上并产生相应的荧光，通过计算能量转移比率，可以实现对目标miRNA的定量分析。这种分子探针体系具有相当高的特异性，可以准确识别同一miRNA家族中高度相似的miRNA。

微流控光学芯片上的核酸检测使得样品体积从常规的200μL大幅减小至1μL，而且液滴的包裹避免了空气中核酸酶的降解。相比于传统的光学系统，集成光纤的微流控芯片成本低廉、体积小巧、定位精准、检测性能优越，并且避免了光学元件复杂的调节对准。这种微流控光学平台还可以集成不同的光学元件如透镜、波导、光栅等，实现更复杂的生化检测功能。同时，可以通过核酸扩增手段如RCA、PCR和HCR反应等，进一步提升核酸检测的灵敏度，还可将应用拓展至蛋白及小分子代谢物的分析研究。

综上所述，研究人员设计了一种基于FRET原理检测miRNA的集成微流控光学平台。该系统凭借其小巧、便携、操作简易的特点，在临床即时诊断(POCT)应用中具有很大的潜力，可促进低成本、微型、便捷、智能的医疗手段的大力发展。